INTRODUÇÃO

Os procedimentos para preparações citológicas com alta frequência de metáfases para a análise de cariótipos de plantas dependem do estabelecimento de uma rotina de obtenção de raízes apresentando meristemas com alto índice mitótico. Normalmente, sementes recémgerminadas são a melhor fonte de tais raízes, mas em casos de espécies que produzem sementes muito pequenas ou de difícil germinação, outros métodos de indução de raízes devem ser explorados, tais como enraizamento de estacas em vasos ou em meio de cultura. Outro aspecto altamente desejável é a obtenção de preparações com alta frequência de metáfases apresentando cromossomas com morfologia nítida. Vários pré-tratamentos para acúmulo de metáfases têm sido descritos em plantas, tais como a combinação de agentes inibidores do fuso mitótico e da síntese protéica, bem como o emprego de hidroxiuréia para sincronização das células meristemáticas.

A CITOLOGIA

Citologia, atualmente designada Biologia Celular, é a ciência que estuda a estrutura, a composição e a fisiologia das células, através das membranas celulares, do citoesqueleto, das organelas citoplasmáticas e dos componentes nucleares.

A palavra "citologia" vem do grego, onde kytos = célula e logos = estudo.

A Citologia é um dos ramos das ciências naturais e a sua história está intimamente relacionada com o advento do microscópio.

O nome célula foi utilizado pela primeira vez em 1665, pelo cientista inglês Robert Hooke em 1665, ao fazer a primeira observação de células em fragmento de cortiça.

A Citologia (Biologia Celular) progrediu substancialmente no último século graças ao aumento do poder de resolução dos instrumentos de análises, desenvolvimento de novas tecnologias e à convergência da citologia com a Genética (Citogenética), Fisiologia (Fisiologia Celular), Bioquímica (Citoquímica), Imunologia (Imunocitoquímica), entre outras ciências.

Praticamente todas as transformações funcionais e físico-químicas do organismo têm lugar na arquitetura molecular da célula, pelo que o conhecimento da sua organização submicroscópica ou ultra-estrutural é de interesse fundamental.

O descobrimento de sequências de aminoácidos, estruturas e disposição tridimensional da molécula, os estudos sobre enzimas, o modelo molecular do DNA, fizeram da Citologia um dos ramos mais importantes das ciências biológicas, tornando-se muito importante para a Genética, Bioquímica e Patologia.

Atualmente, pode-se afirmar que a citologia estuda os problemas celulares em todos os seus níveis, começando pela organização molecular.

TÉCNICAS CITOLÓGICAS

Entende-se por técnicas citológicas o conjunto de operações a que é preciso submeter o material biológico para ficar em condições de ser observado ao microscópio. Estas técnicas podem ser divididas em dois grandes grupos de preparações: para microscopia óptica e para microscopia electrónica.

Microscopia óptica São variados os métodos de preparação de material citológico para ser observado ao microscópio óptico. Podemos considerar 3 grandes tipos de preparações: I. Preparações a fresco ou extemporâneas II. Preparações definitivas sem inclusão III. Preparações definitivas com inclusão (inclusão é uma das etapas da técnica, que consiste em colocar a peça citológica num bloco constituído por uma substância protectora e de suporte, que permita efectuar facilmente o corte).

I - Preparações a fresco: É um tipo de preparação que pode ser utilizada a qualquer momento, porque permite uma observação rápida e imediata. Também é designada por preparação extemporânea. A este tipo de preparação se devem as primeiras descobertas científicas, pois permite a observação de peças ou microorganismos em condições de vida, apesar de ser por um curto período. Habitualmente, uma preparação é constituída por uma lâmina de vidro na qual se coloca o material biológico a observar, sobrepondo-se a este uma lamela de vidro. Por vezes usam-se outros tipos de lâminas na observação de preparações a fresco, como as lâminas escavadas, que têm no centro uma cavidade. O material fica, assim, rodeado de maior quantidade de líquido e ao mesmo tempo não há compressão da lamela sobre as estruturas a observar.

Observação in vivo e in vitro A observação in vivo corresponde ao estudo das células no seu próprio meio. É um método muito utilizado para o estudo dos seres vivos de pequenas dimensões (protozoários e bactérias). A observação in vitro permite o estudo das células vivas, sendo estas previamente retiradas do meio natural em que vivem e colocadas em soluções com composição química bem definida, de forma a que se processe sem qualquer alteração o metabolismo celular. A – Líquidos fisiológicos Quando há a preocupação de se observar todas as manifestações vitais do material em estudo, procura-se rodear a peça de líquidos favoráveis à sua vivência, cuja osmolaridade deve igualar aquela em que o ser vivo habitualmente vive. Esses líquidos ou meios denominam-se fisiológicos ou isotónicos e os mais usados são: Líquido fisiológico (artificial) – Solução aquosa de cloreto de sódio a 9 /1000, para células de mamíferos e a 7/1000 para células de animais poiquilotérmicos. Líquido fisiológico do tecido sanguíneo (plasma sanguíneo) – obtido por coagulação do sangue, seguida de centrifugação, adição anticoagulante, centrifugação e colheita do sobrenadante – plasma sanguíneo. Líquido de Ringer – geralmente utilizado para exame de células de vertebrados poiquilotérmicos e invertebrados. Além da isotonia, visa fornecer às células os elementos minerais existentes nos meios em que vivem e cuja iria prejudicar o seu metabolismo e estrutura. Esta solução pode apresentar diferentes composições quantitativas, nomeadamente quando são utilizadas em células de animais homeotérmicos (mamíferos e aves) ou poiquilotérmicos. Água do mar ou do rio – natural e filtrada ou artificial. B – Coloração vital Quando há necessidade de pôr em evidência certas estruturas celulares, procede-se à sua coloração. Os corantes são substâncias que aumentam o contraste e permitem distinguir regiões com igual índice de refracção. Porém, tem de haver uma precaução se queremos que o protoplasma não morra. Para isso são usadas soluções muito diluídas de corantes vitais, tais como: azul de metileno, vermelho neutro, azul do Nilo, vermelho do Congo, azul brilhante de cresilo, verde Janus, castanho de Bismark, azur I, azur II, etc., em concentrações da ordem de 1/10.000 a 1/50.000. Com as colorações vitais não só observamos as células e microorganismos como também granulações de secreção, vacúolos digestivos, grânulos, organelos citoplasmáticos e ainda partes do núcleo como, por exemplo, o nucléolo e cromossomas.

Muitos corantes coram certas estruturas celulares de uma cor diferente da sua. Estes corantes reveladores de reacções químicas são chamados metacromáticos. Por exemplo: o vermelho neutro, solúvel em água destilada com cor vermelho-violácea, vira para vermelho-cereja sob a influência de vestígios de ácidos e para amarelo-acastanhado ou alaranjado pela acção das bases. Alguns corantes vitais podem mesmo indicar o grupo químico a que pertence um determinado elemento da célula, o que se utiliza em técnicas de histoquímica. Por exemplo, o Sudão III cora as granulações de gordura nas células vivas.

Limitações do exame a fresco

• Só se aplica a materiais suficientemente transparentes

• A nutrição das células não é suficiente e, dentro de horas, as células começam a mostrar sinais de degenerescência, acabando por morrer.

• As observações têm, assim, uma duração muito limitada sendo, portanto, preparações efémeras que não se podem conservar.

A Fixação e Desidratação: constituem a primeira etapa para obtenção de uma preparação definitiva. Consiste, por um lado, num processo que mata as células rapidamente, impedindo o processo de destruição das células, e por outro lado, endurece parcialmente os tecidos de modo a poderem suportar as etapas seguintes.

Pode ser realizada por agentes físicos como o calor (método muito utilizado para fixação de bactérias) ou o frio (fixação por congelação). Usualmente, emprega-se a fixação química por meio de substâncias chamadas fixadores.

Após a fixação, o material deverá ser incluso em parafina para que possa ser seleccionado, mas como a parafina e a água não são miscíveis, vai ser necessário proceder à desidratação do material através da remoção gradual da água dos tecidos, sendo esta substituída por álcool.

Esfregaço: é uma técnica citológica útil para materiais biológicos como líquidos orgânicos (ex.: sangue) e colónias de bactérias. Coloca-se uma gota do líquido, em estudo, sobre uma lâmina, e com a ajuda de outra lâmina ou lamela espalha-se bem e deixa-se secar ao ar. Depois de seco, o material biológico pode ser fixado e corado (preparação definitiva).

TÉCNICA DE ESFREGAÇO

Esmagamento é uma técnica usada quando células animais ou vegetais têm uma fraca aderência (ex.: células da raiz da cebola). Para realizar um esmagamento coloca-se um pequeno fragmento do tecido entre a lâmina e a lamela e, de seguida, faz-se uma peque- na pressão com o cabo de uma agulha de dissecção ou com o polegar, de modo a provocar o esmagamento do tecido, o que faz com que as células se espalhem, formando uma fina camada que é facilmente atravessada pela luz (durante a observação no MOC)

TÉCNICA DE ESMAGAMENTO

Na sua maioria, as células fazem parte dos tecidos que precisam ser cortados para poderem ser observáveis ao microscópio. Na técnica do corte podem ser utilizadas lâminas adequadas ou então aparelhos especializados chamados micrótomos.

O fragmento de tecido fixado, a que também se dá o nome de peça é, geralmente incluído num material que o envolve e nele penetra, devendo possuir propriedades físicas que facilitam o corte. O material frequentemente usado para tal é a parafina, que depois de endurecer e formar um bloco onde tem incluído no seu interior o material biológico, é cortado em fatias 'finas com uma espessura entre 3 a 6 microns, a esta técnica chama-se inclusão.

TÉCNICA DE CORTE COM UM MICRÓTOMO

A maioria das estruturas das células só é observada ao microscópio óptico é composto depois de tratadas com corantes - técnica de coloração.

Para se proceder à coloração de uma preparação definitiva, cujos cortes sejam provenientes de peças incluídas em parafinas, é necessário remover esta substância e hidratar a material técnica de hidratação.

Como quase todos os constituintes celulares são transparentes e incolores, dificultando o seu estudo microscópico, tomou-se necessário vencer estas dificuldades, criando numerosos processos de coloração que facilitam a observação dos diferentes constituintes da célula.

Mas não existe uma técnica de coloração que sozinha ponha em evidência todas as estruturas celulares. Por isso, para se conhecer a morfologia de todos os constituintes de um tipo de célula, diversos preparados são feitos, cada um deles evidenciando uma certa estrutura.

Cada corante reage apenas com certos elementos celulares, que ficam contrastados em relação aos outros, facilitando a observação, como podes verificar no seguinte quadro.

Corantes	Extruturas celular
Orceina acetica	Cromossomas
Água iodada	Núcleo, grãos de amido
Eosina	Citoplasma
Soluto de Lugol	Parede celulosa, grãos de amido
Vermelho neutro	Vacúolos
Azul-de-metileno	Núcleo

Existem dois tipos de corantes: os corantes naturais e os corantes artificias. Os corantes naturais são extraídos de animais e plantas, como por exemplo, o carmim e a himotoxilína, Os corantes artificiais são sintetizados em laboratório, como por exemplo, a eosina e o azul-de-metileno.

Uma vez o tecido corado, este é colocado sobre um meio de montagem. Tradicionalmente, usam-se algumas gotas de bálsamo-do-Canadá dissolvidas em xilol. Cobre-se a preparação com uma lamela, tendo o cuidado para que não se formem bolhas de ar.

Uma vez seca, a preparação deverá ser devidamente identificada, podendo-se usar uma etiqueta para tal.

CONCLUSÃO

Cheguei a conclusão de que na microscopia óptica podem-se utilizar dois tipos de preparações: as temporárias ou extemporâneas, usadas para a observação imediata do material, e as definitivas, preparações que podem ser guardadas e observadas várias vezes. A preparação do material a observar ao microscópio engloba várias técnicas. Inicia-se com a colheita do material, que deve ocorrer em condições em que o objecto de estudo não seja danificado. A fixação, inclusão, corte, coloração e montagem são algumas das técnicas utilizadas na preparação do material para observação em microscopia óptica. Na microscopia electrónica, são utilizadas técnicas de inclusão, corte, fixação e contraste para a preparação do material a observar.

BIBLIOGRAFIA

JUNQUEIRA , C. U.; JUNQUEIRA , L. M. M. S. Técnicas básicas de citologia e
histologia. S. Paulo: Santos, 1983. 123 p.

MIGUEL Afonso, AGOSTINHO Piedade Silissoli: Biologia (Manual do Aluno 9ª Classe) Texto Editores, 2ª Edição, Luanda, 2014.

Luzia F·tima GonÁalves Caputo Ester Maria Mota Lycia de Brito Gitirana: Técnicas citológicas. Disponível em: http://www.epsjv.fiocruz.br/upload/d/capitulo_4_vol2.pdf. Acessado aos 20 de Março de 2015.

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